H
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Vol.0
4
| Núm.0
2
|
Abr
–
Jun
| 202
6
| www.horizonnexusjournal.editorialdoso.com
ISSN:
3073
-
1275
25
Articulo
Caracterización microbiana y dinámica de crecimiento
poblacional de bacterias acido lácticas en ensilajes de maíz
(
Zea Mays
)
y alfalfa
Microbial characterization and population growth dynamics of lactic acid
bacteria in corn (
Zea Mays) and alfalfa silages
Denise Dayana Guevara Arevalo
1
,
Angel Virgilio Cedeño Moreira
2
,
Milena Anahis Cerezo
Alejandro
3
,
Jairo Eloy Velaña Navarrete
4
, Cesar Luis Noboa Marin
5
y
Ítalo Fernando
Espinoza
Guerra
6
1
Universidad
Técnica Estatal de Quevedo
,
Ecuador
,
Quevedo
;
https://orcid.org/0009
-
0009
-
7087
-
9122
2
Universidad
Técnica Estatal de Quevedo, Ecuador, Quevedo
;
https://orcid.org/0000
-
0002
-
6564
-
5569
;
acedenom@uteq.edu.ec
3
Universidad Técnica Estatal de Quevedo, Ecuador,
Quevedo
;
https://orcid.org/0009
-
0000
-
0735
-
2007
;
milena.cerezo2016@uteq.edu.ec
4
Universidad
Técnica Estatal de Quevedo, Ecuador, Quevedo
;
https://orcid.org/0009
-
0003
-
8149
-
5200
;
jairo.velana2017@uteq.edu.ec
5
Universidad
de
Guayaquil
,
Ecuador, Guayaquil;
https://orcid.org/0009
-
0003
-
9052
-
8481
;
cesar.noboam@ug.edu.ec
6
Universidad
Técnica Estatal de Quevedo, Ecuador, Quevedo;
https://orcid.org/0000
-
0002
-
2975
-
3087
;
iespinoza@uteq.edu.ec
*
Correspondencia:
denise.guevara2016@uteq.edu.ec
;
acedenom@uteq.edu.ec
.
https://doi.org/10.70881/hnj/v4/n2/122
Resumen:
La
inclusión
de leguminosas en mezclas ensiladas
aporta
beneficios nutricionales
, pero
plantea
un ret
o
fermenta
tivo
por
la alta
capacidad tampón de la alfalfa y su bajo contenido de azúcares solubles. Se
empleó
un diseño completamente al azar con cuatro tratamientos:
T1 (100%
maíz), T2 (5% alfalfa), T3 (10% alfalfa) y T4 (15% alfalfa), con cinco
repeticiones. Los
ensilajes
se almacenaron
durante
30 días. Se evaluaron
aerobios mesófilos, mohos y levaduras,
así como
BAL
iniciales
y
durante la
cinética
de fermentación
.
Ad
emás,
s
e aplicaron
pruebas bioquímicas
(catalasa, amilasa, ureasa y tinción de Gram) y se cuantificaron metabolitos
incluyendo
ácido acético y etanol. Los
resultados mostraron que
los
aerobios
mesófilos alcanz
aron
1,260 UFC/g en T4
, mientras que
mohos y levaduras
llegaron
418.6 UFC/g en el mismo tratamiento. Las BAL iniciales fueron
mayores en T1
(
497.4 UFC/g
)
.
El
á
cido
acético
alcanzó
5.10 g/L en T3
,
mientras que el etanol
fue máximo en
T2
(
2.10 g/L
)
.
La c
inética
presentó
el
pico e
n T2
,
con 7.11×10⁸ UFC/mL a las 32 h,
con
fases logarítmicas más
prolongadas a menores inclusiones de alfalfa;
mientras que
T4
mostró
menor
estabilidad fermentativa, probablemente por su
capacidad
tampón.
En
conjunto, incluir
alfalfa
hasta un 10%
favorece BAL y
la
acidificación sin
comprometer la estabilidad microbiológica, aportando criterios para optimizar
ensilajes mixtos para rumiantes
y
sostenibilidad
de los sistemas forrajeros.
Palabras clave:
B
acterias
ácido
-
lácticas; ensilaje mixto; fermentación
anaeróbica; maíz; alfalfa; estabilidad microbiológica; ácido láctico
Cita:
Guevara Arevalo, D. D.,
Cedeño Moreira, A. V., Cerezo
Alejandro, M. A., Velaña
Navarrete, J. E., Noboa Marin, C.
L., & Espinoza Guerra, Ítalo F.
(2026). Caracterización
microbiana y dinámica de
crecimiento poblacional de
bacterias acido lácticas en
ensilaj
es de maíz (Zea Mays) y
alfalfa.
Horizon Nexus
Journal
,
4
(2), 25
-
41.
https://doi.org/10.70881/hnj/v
4/n2/122
Recibido:
0
1
/0
3
/202
6
Revisado:
04/
0
4
/202
6
Aceptado:
06
/0
4
/202
6
Publicado:
21
/0
4
/202
6
Copyright:
© 202
6
por los
autores. Este artículo es un
artículo de acceso abierto
distribuido bajo los términos y
condiciones de la
Licencia
Creative Commons, Atribución
-
NoComercial 4.0 Internacional.
(
CC
BY
-
NC
)
.
(
https://creativecommons.org/lice
nses/by
-
nc/4.0/
)
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26
Abstract:
The inclusion of legumes in silage mixtures provides nutritional
benefits but presents a fermentation challenge due to
alfalfa's high buffering
capacity and low soluble sugar content. A completely randomized design with
four treatments was used: T1 (100% corn), T2 (5% alfalfa), T3 (10% alfalfa),
and T4 (15% alfalfa), with five replicates. The silages were stored for 30 day
s.
Mesophilic aerobes, molds, and yeasts were evaluated, as well as initial and
fermentation kinetics LAB. Biochemical tests (catalase, amylase, urease, and
Gram staining) were also performed, and metabolites, including acetic acid
and ethanol, were quanti
fied. The results showed that mesophilic aerobes
reached 1,260 CFU/g in T4, while molds and yeasts reached 418.6 CFU/g in
the same treatment. Initial lactic acid bacteria (LAB) levels were highest in T1
(497.4 CFU/g). Acetic acid reached 5.10 g/L in T3, wh
ile ethanol was highest
in T2 (2.10 g/L). Fermentation kinetics peaked in T2, with 7.11 × 10⁸ CFU/mL
at 32 h, exhibiting longer logarithmic phases at lower alfalfa inclusions. T4
showed lower fermentative stability, likely due to its buffering capacity.
Ov
erall, including alfalfa up to 10% promotes LAB and acidification without
compromising microbiological stability, providing criteria for optimizing mixed
silages for ruminants and the sustainability of forage systems.
Keywords:
L
actic acid bacteria; mixed
silage; anaerobic fermentation;
maize; alfalfa; microbiological stability; lactic acid
1. Introducción
El ensilaje de maíz (
Zea mays
) se ha consolidado como una de las alternativas más utilizadas
para la conservación de forrajes en sistemas de
producción de rumiantes, debido a su alto
rendimiento, elevada disponibilidad de carbohidratos solubles y adecuada digestibilidad,
características que favorecen una fermentación eficiente y la obtención de silos de buena calidad
(Shah
et al
., 2025; Tuovine
n
et al
., 2025). No obstante, la necesidad de optimizar el perfil
nutricional de las dietas, especialmente en términos de proteína y balance de nutrientes, ha
impulsado el interés por el uso de ensilajes mixtos que incorporen leguminosas como la alfalfa
(
M
edicago sativa
), reconocida por su alto contenido proteico y su aporte de minerales, lo cual
puede mejorar el desempeño productivo y el aprovechamiento del forraje en rumiantes (Niyigena
et al
., 2024).
A pesar de sus ventajas nutricionales, la alfalfa pres
enta limitaciones tecnológicas relevantes
para el proceso de ensilaje. Su menor concentración de azúcares fermentables y su alta
capacidad tampón pueden retrasar la disminución del pH durante las primeras etapas de
fermentación, favoreciendo el crecimiento
de microorganismos indeseables y comprometiendo
la estabilidad aeróbica del silo (Silva
et al
., 2025). En este contexto, las bacterias ácido lácticas
(BAL) desempeñan un rol determinante al transformar los carbohidratos solubles en ácido láctico
y otros m
etabolitos, promoviendo la acidificación del medio y la estabilización anaeróbica del
ensilaje (Okoye
et al
., 2023). La dinámica poblacional de las BAL, así como la evolución de
comunidades microbianas como aerobios mesófilos, mohos y levaduras, está influ
enciada por el
sustrato disponible y por la proporción de leguminosa incluida en la mezcla (Yan
et al
., 2022).
Diversos estudios han señalado que la inclusión moderada de leguminosas puede favorecer el
valor nutritivo del ensilaje; sin embargo, sus efectos
sobre la cinética fermentativa y la estabilidad
microbiológica no son consistentes, debido a variaciones en el nivel de inclusión, las condiciones
de ensilado y la composición inicial del forraje (Li
et al
., 202
3
). En particular, existe información
limita
da sobre cómo niveles crecientes de alfalfa entre 5% y 15% modifican la dinámica temprana
de BAL durante las primeras 48 horas, fase crítica en la que se define la velocidad de acidificación
y la dominancia microbiana del proceso fermentativo
(Liu
et al
.,
2018).
Por último, el presente estudio tiene como objetivo caracterizar
el microbiota
de ensilajes de maíz
con inclusiones crecientes de alfalfa (5, 10, 15%), con énfasis en la dinámica poblacional de las
bacterias ácido lácticas durante las primeras etapa
s de fermentación y su relación con la
producción de metabolitos claves como ácido acético y etanol. Los resultados aportarán
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información valiosa para optimizar las estrategias de conservación de forrajes, reduciendo
pérdidas, mejorando la calidad nutritiv
a y contribuyendo a la sostenibilidad de los sistemas
ganaderos
2. Materiales y Métodos
Lugar de investigación
La investigación se desarrolló en el Campus ¨La María¨, en el Laboratorio de Biología y
Microbiología de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo en la provincia de Los Ríos, Cantón
Mocache, Ecuador.
Manejo específico del experimento
El maíz forrajero se
obtuvo de una parcela establecida en el Campus Experimental “La María”.
Se realizó un corte de igualación a los 85 días, no se realizó fertilización ni riego. La Alfalfa se
obtuvo del mercado del cantón Quevedo, provincia de Los Ríos.
Se prepararon cuatr
o silos de maíz forrajero por tratamiento con inclusiones de alfalfa: Para ello,
se emplearon 20 silos experimentales (con cinco réplicas por tratamiento), cada uno con una
capacidad de almacenamiento de 40 kg. El forraje se cosecho en su punto óptimo de m
adurez a
los 85 días. Tanto el maíz forrajero como la alfalfa se picaron a un tamaño de partícula
aproximado de 2 cm, utilizando una picadora de pasto (Trapp® ES 400, Brasil), por último, se
ensilo utilizando una máquina ensiladora (Silopack J402). Los sil
os se sellaron herméticamente
y fueron almacenados a temperatura ambiente (26 ± 0,6 ºC), evitando la exposición directa a la
radiación solar. Los silos se abrieron después de 30 días de almacenamiento.
En este estudio no se utilizó animales. Todas las mues
tras se manipularon bajo condiciones
estériles para prevenir contaminaciones cruzadas y asegurar la repetibilidad de los resultados.
Tratamientos evaluados
Los datos fueron registrados y tabulados utilizando hojas de Excel para su correcta organización
y procesamiento. Posteriormente, el análisis estadístico se llevó a cabo mediante el software
SAS, permitiendo evaluar la variabilidad de los resultados. Para
determinar las diferencias
significativas entre las medias, se aplicó la prueba de rangos múltiples de Tukey, los resultados
se presentan en la Tabla
1
Tabla
1
.
Descripción de los tratamientos
Tratamientos
Descripción del tratamiento
Repeticiones
T1
100%
ensilaje de maíz
5
T2
95%
ensilaje de maíz + 5%
Alfalfa
5
T3
90%
ensilaje de maíz + 10%
Alfalfa
5
T4
85%
ensilaje de maíz + 15%
Alfalfa
5
Variables evaluadas
Aislamiento y recuento de colonias
Inicialmente, se pesó 1,0 g de cada muestra de ensilaje, la cual fue colocada en un mortero
estéril, añadiendo 90 mL de agua destilada. Las muestras fueron trituradas manualmente hasta
lograr una suspensión homogénea. Posteriormente, se preparó una dilució
n seriada 10
+
,
tr
ansfiriendo 100
µ
L de la suspensi
ó
n macerada a un tubo de microcentr
í
fuga que conten
í
a
previamente 900
µ
L de agua destilada est
é
ril, logrando un volumen final de 1 ml.
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28
Siguiendo la metodología descrita por De MAN
et al
.
,
(1960), se elabor
aron tres tipos de medios
de cultivo: uno específico para bacterias ácido lácticas, otro para aerobios mesófilos, y un tercero
para mohos y levaduras. Cada medio fue preparado en matraces de 1000 mL hasta un volumen
final de 600 mL. La esterilización se ef
ectuó mediante autoclave a 121°C durante 40 minutos.
Simultáneamente, se esterilizaron 120 placas Petri vacías. Posteriormente, bajo condiciones de
flujo laminar, se expusieron las placas, micropipetas, puntas estériles, asas de siembra de vidrio
y un mech
ero de seguridad a radiación ultravioleta (UV) durante 15 minutos. Posteriormente, se
distribuyó en las 120 placas el agar correspondiente, una vez solidificados los medios de cultivo
en las placas, se realizó una segunda exposición UV de 15 minutos para g
arantizar la esterilidad
superficial.
De acuerdo con el procedimiento descrito por Miles y Misra (1938), en condiciones de asepsia,
se inocularon 10 µL de la dilución seriada 10
⁴
s
obre la superficie de cada placa, utilizando
micropipetas y distribuyendo d
e forma homogénea con un asa de siembra estéril. Se sembraron
40 placas para cada tipo de medio.Las placas sembradas fueron cubiertas individualmente en
fundas de polietileno (polifan) para evitar la contaminación cruzada y se incubaron a 28°C ± 2°C
durant
e 24 horas en estufa microbiológica.
Transcurrido el periodo de incubación, se procedió a la enumeración de las unidades formadoras
de colonias (UFC) mediante un contador de colonias digital. Los resultados obtenidos se
expresaron como UFC por gramo de mue
stra, considerando el factor de dilución empleado.
Caracterización microscópica apoyada en análisis bioquímicos
A partir de las placas de cultivo, se seleccionaron 24 placas de referencia, eligiéndose dos
colonias morfológicamente
representativas por placa, obteniendo un total de 48 cepas para
realizar las pruebas bioquímicas.
Tinción de Gram
Siguiendo el procedimiento propuesto por
Has
Paray
et al
.,
(
2023
),
se procedío a caracterizar
cada colonia mediante tinción de Gram. Para ello
, se realizó un frotis a cada colonia previamente
identificada, depositando en un portaobjeto, utilizando una pequeña cantidad de cada colonia
homogeneizada en agua destilada estéril. Los frotis fueron fijados por flameado suave y teñidos
secuencialmente c
on cristal violeta (30 s), yodogram (30 s), alcohol cetona (30 s) y safranina (40
s), con enjuagues intermedios de agua corriente entre cada reactivo.
Finalmente, la observación se realizó utilizando un microscopio con objetivo de inmersión (100X),
permiti
endo distinguir bacterias Gram positivas (coloración azul/violeta) de Gram negativas
(rosado/rojo).
Prueba de Catalasa
Para evaluar la actividad catalasa, se colocó una pequeña cantidad de la colonia en un
portaobjetos, luego se añadió una gota de agua oxi
genada y se observó la reacción. La
producción inmediata de burbujas gaseosas se interpretó como prueba positiva, mientras que su
ausencia como prueba negativa, siguiendo lo establecido por
Mahmoud
et al
.,
(
2024
).
Prueba de Ureasa
La prueba de ureasa se realizó utilizando un medio compuesto por agar (7,5 g), cloruro de sodio
(5 g), dextrosa (1 g), fosfato dipotásico (20 g), peptona especial (1 g), urea (10 g) y rojo de metil
como indicador, todo diluido en 1000 mL de agua destilada,
siguiendo el protocolo clásico
descrito por Christensen (1946). La mezcla fue esterilizada a 121 °C en autoclave y, aún tibia, se
distribuyó en 48 tubos de ensayo estériles bajo condiciones asépticas, de acuerdo con el
protocolo descrito por Christensen (
1946).
Para la inoculación, se preparó una suspensión bacteriana en microcentrífugas con 10 µL de
agua destilada y una pequeña porción de cada colonia seleccionada. Esta suspensión se
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29
transfirió a los tubos con el medio solidificado. Los tubos fueron incub
ados a 28 °C ± 2 °C durante
48 horas.
Inicialmente, el medio presentaba un color rojo intenso, característico de un ambiente ácido o
neutro. Sin embargo, cuando la ureasa estuvo activa, la hidrólisis de la urea liberó amoníaco,
elevando el pH y provocando
que el indicador cambiara su color a amarillo. Por consiguiente, un
cambio a amarillo se interpretó como un resultado positivo para la actividad ureásica, mientras
que la ausencia de cambio, manteniendo el color rojo intenso, indicó un resultado negativo,
reflejando la falta de dicha actividad en la muestra analizada.
Prueba de Amilasa
La prueba de actividad amilásica se realizó siguiendo la metodología clásica desarrollada por
Huggins y Russell (1948), la cual fue adaptada para este estudio. Para ello, se
preparó un medio
de cultivo compuesto por almidón (10 g), peptona especial (5 g), extracto de levadura (3 g), agar
(15 g) y bromofenol como indicador de pH, disueltos en 1000 mL de agua destilada, obteniendo
una solución de color verde. Esta mezcla fue est
erilizada en autoclave a 121 °C y utilizada para
preparar 12 placas de agar.
Cada placa fue dividida en cuatro sectores, permitiendo la inoculación de una colonia por sección.
En total, se sembraron 48 colonias distribuidas en las 12 placas. Antes y despué
s de agregar la
solución, las placas fueron expuestas a radiación ultravioleta (UV) para controlar la
contaminación y asegurar condiciones estériles. Para la siembra, se utilizó un asa plástica para
tomar cada colonia, realizando movimientos en zigzag desd
e la periferia hacia el centro de cada
sección, asegurando una distribución homogénea del inóculo.
Tras la incubación, la actividad amilásica se evaluó observando cambios en la coloración del
medio. Se identificaron zonas decoloradas amarillas alrededor de
las colonias con actividad
enzimática, contrastando con áreas de color turquesa o azul en sectores sin actividad. La
decoloración indica la hidrólisis del almidón por la amilasa, mientras que las zonas teñidas indican
ausencia de dicha actividad
Determina
ción de ácido acético
Para la determinación de ácido acético producido por las bacterias, se empleó un método
volumétrico de titulación ácido
-
base, como lo describió
Berasarte
et al.,
(1976). Inicialmente
, las
muestras de cultivo fueron centrifugadas a 4000 rpm durante 10 minutos para eliminar las células
y partículas sólidas. El sobrenadante obtenido fue filtrado a través de un filtro de 0.22
μ
m para
asegurar la clarificación de la muestra. Posteriormente
, se pipetearon 25 mL de cada
sobrenadante en matraces Erlenmeyer y se adicionaron 2
-
3 gotas de fenolftaleína como
indicador de pH.
La titulación se llevó a cabo agregando gota a gota una solución de hidróxido de sodio (NaOH)
0.1 N, bajo agitación constan
te, hasta observar un cambio de color estable a rosa, indicativo del
punto final de la titulación (pH ~8.3). El volumen de NaOH consumido fue registrado para cada
muestra. Para calcular la concentración de ácido acético en las muestras, se aplicó la relaci
ón
estequiométrica entre el volumen y la normalidad de NaOH y el volumen de la muestra titulada,
ajustando posteriormente a gramos por litro considerando el peso molecular del ácido acético.
Como control, se realizó la misma titulación sobre el medio de c
ultivo no inoculado para corregir
la acidez basal.
Cuantificación de alcohol
En cuanto a la cuantificación de alcohol (etanol) producido por las bacterias, se utilizó un método
enzimático basado en un kit comercial. De igual forma, las muestras de cultivo
fueron
centrifugadas y filtradas para obtener un sobrenadante libre de células y partículas. Siguiendo
las instrucciones del fabricante del kit, se prepararon las soluciones enzimáticas y tampones
requeridos. En cubetas para espectrofotometría se mezclaron
volúmenes determinados del
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sobrenadante con los reactivos del kit, incubándose la mezcla durante el tiempo y temperatura
especificados (generalmente entre 5 y 10 minutos a temperatura ambiente o 37 °C).
La absorbancia resultante se midió a 340 nm, corres
pondiente a la formación de NADH durante
la reacción catalizada por el alcohol deshidrogenasa. Para la cuantificación, se elaboró una curva
de calibración con estándares de etanol de concentración conocida, que permitió interpolar la
concentración de etano
l presente en las muestras analizadas.
Se realizaron controles en blanco
y las mediciones fueron realizadas por duplicado para garantizar la precisión y reproducibilidad
de los resultados, siguiendo el protocolo descrito por
(Ivory
et al.,
2021
).
Análisis
estadístico.
Los datos obtenidos de los recuentos bacterianos fueron analizados mediante estadística
descriptiva, como medias y desviaciones estándar. Para la comparación de los distintos
tratamientos de ensilaje y las diferencias entre los momentos de mu
estreo, se empleó un análisis
de varianza (ADEVA). En caso de diferencias significativas, se aplicó la prueba de comparación
de medias de Tukey (p < 0.05).
Además, se realizó un análisis de correlación de Pearson entre
la cantidad de bacterias ácido
lácticas, con el fin de determinar cómo estos parámetros influyen
en la calidad y estabilidad del ensilaje.
3.
Resultados
Reencuentro microbiano
por tratamiento (T1
-
T4).
Numero de colonias aerobios mesófilos
Se observaron diferencias significativas entre
tratamientos en los tres grupos microbianos
evaluados. Los aerobios mesófilos fueron más altos en T4 (15% Alfalfa) con un promedio de
(~1260 UFC/g) colonias por placa, superando a T1, T2 y T3 (257, 289 y 435 UFC/g), lo que es
consistente con la mayor capac
idad tampón de la alfalfa y su impacto en la estabilidad aeróbica.
Figura
1
.
Recuento de aerobios mesófilos (UFC/g) con diferentes inclusiones de alfalfa: T1 (100% maíz),
T2 (5% alfalfa), T3 (10% alfalfa) y T4 (15% alfalfa). Las barras representan la media ± EE (n = 5). Letras
diferentes sobre las barras indican diferencias signif
icativas entre
tratamientos según la prueba de Tukey
(p < 0.05).
Numero de colonias mohos y levaduras
Se observaron diferencias significativas (p < 0.05) en el recuento de mohos y levaduras entre
tratamientos. El tratamiento T4 (15% alfalfa) presentó el va
lor más alto (~418,6 UFC/g),
significativamente superior a T3 (10% alfalfa, ~74,4 UFC/g). Los tratamientos T1 (100% maíz) y
T2 (5% alfalfa) mostraron valores intermedios (~273,5 y 186 UFC/g).
El análisis de Tukey indicó que T4 y T1
-
T2 se agruparon estadísticamente, diferenciándose de
T3. Estos resultados sugieren que la inclusión de alfalfa influye en niveles elevados promueve la
proliferación fúngica, posiblemente a cambios en la disponibilida
d de substratos fermentables o
en las condiciones microambientales del ensilaje.
a
b
b
b
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
T4
T3
T2
T1
Número de colonias
Tratamientos
T4
T1
T2
T3
,}]}vE˘:}vo
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a
ab
ab
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400
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T1
T2
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Tratamientos
a
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Cinética de crecimiento de la población microbiana
Al integrar los resultados de los cuatro tratamientos, se observan diferencias claras en la
dinámica poblacional de las BAL. El ensilaje con 5% de alfalf
a (T2) alcanzó el mayor pico de
crecimiento (7,11×10⁸ UFC·mL
¹
a
las 32 h), superando significativamente a los dem
á
s
tratamientos, lo que sugiere que esta proporci
ó
n gener
ó
condiciones
ó
ptimas para la proliferación
bacteriana. En contraste, el
tratamiento con 15% de alfalfa (T4) presentó el pico más bajo
(4,17×10⁸ UFC·mL
¹
)
, confirmando que una elevada capacidad tamp
ó
n limita la acidificaci
ó
n
inicial y restringe el crecimiento de BAL.
El tratamiento T1 (100% maíz) mostró un crecimiento inicial
más alto (2,16×10⁸ UFC·mL
¹
)
, pero
con un declive m
á
s temprano, mientras que T3 (10% alfalfa) se mantuvo en un nivel intermedio
en todo el proceso. Estos resultados refuerzan la idea de que la inclusi
ó
n moderada de alfalfa
favorece una fermentación más efi
ciente, mientras que su exceso compromete la dominancia de
las BAL y, por ende, la calidad fermentativa del ensilaje.
Figura
4
.
Cinética de crecimiento de bacterias ácido lácticas (BAL) durante 8 a 48 horas de incubación en
ensilajes con diferentes niveles de inclusión de alfalfa: T1 (100% maíz), T2 (5% alfalfa), T3 (10% alfalfa) y
T4 (15% alfalfa).
4.
Discusión
El incremento sign
ificativo de los aerobios mesófilos observado
se origina
a partir de la
interacción entre las propiedades fisicoquímicas del sustrato y la dinámica microbiológica del
proceso de ensilaje. La alfalfa, a diferencia del maíz, presenta una elevada capacidad ta
mpón
atribuida a su alto contenido de proteínas, aminoácidos y sales minerales, lo cual reduce la
velocidad de acidificación inicial del medio
(Li
et al
., 2023)
. Este efecto amortiguador impide una
rápida disminución del pH durante las primeras fases de la
fermentación, manteniendo valores
cercanos a la neutralidad por un periodo prolongado. Bajo estas condiciones, los
microorganismos aerobios mesófilos encuentran un ambiente favorable para su proliferación,
dado que su crecimiento óptimo ocurre en rangos d
e pH entre 6.0 y 7.0, a diferencia de las
bacterias ácido lácticas que dominan en ambientes más ácidos
(
Wang
et al
.
,
2021)
.
Adicionalmente, la menor concentración de carbohidratos solubles fermentables en la alfalfa
limita la disponibilidad de
sustratos energéticos para las bacterias ácido lácticas, reduciendo su
capacidad competitiva en las etapas tempranas del ensilaje
(
Bisson
et al.
,
2023)
. Este déficit
energético retrasa la transición hacia una fermentación láctica eficiente, caracterizada po
r la
rápida producción de ácido láctico y la consecuente inhibición de microorganismos indeseables
(
Fabiszewska
et al
.,
2019)
. En consecuencia, se genera una ventana ecológica en la cual los
0,00E+00
1,00E+08
2,00E+08
3,00E+08
4,00E+08
5,00E+08
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7,00E+08
8,00E+08
8
16
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UFC/ml
Horas
T1 (100% Maiz)
T2 (5% Alfalfa)
T3 (10% Alfalfa)
T4 (15% Alfalfa)
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aerobios mesófilos y otros microorganismos facultativos pueden mu
ltiplicarse activamente antes
de que se establezcan condiciones anaeróbicas estrictas y de bajo pH
(
Socas
-
Rodríguez
et al.
,
2021)
.
Por otra parte, el elevado contenido de nitrógeno no estructural presente en la alfalfa favorece el
desarrollo de
comunidades microbianas heterótrofas no lácticas, muchas de las cuales poseen
metabolismo aerobio o facultativo
(
Gomes
et al
.
,
2021)
. Estos microorganismos pueden utilizar
aminoácidos y compuestos nitrogenados como fuentes de carbono y energía, incrementan
do su
densidad poblacional en ausencia de una presión selectiva ejercida por ácidos orgánicos
(Li
et
al
., 2023)
. Este fenómeno se ve reforzado por la posible acumulación de productos intermedios
de degradación proteica, como amonio, que contribuyen a mante
ner el pH elevado y perpetuar
condiciones favorables para microbiota no deseada
(Xu
et al
., 2022)
.
La mayor abundancia de bacterias ácido lácticas (BAL) observada
está ligado
fundamentalmente
a
la alta disponibilidad de carbohidratos solubles presentes en
este forraje, los cuales constituyen
el principal sustrato energético para el metabolismo fermentativo de estos microorganismos
(
Guo
et al.,
2023)
. El maíz, rico en azúcares fácilmente fermentables como glucosa, fructosa y
sacarosa, favorece una rápida act
ivación metabólica de las BAL, permitiendo su crecimiento
exponencial en las primeras etapas del ensilaje
(
Navarro
et al.
,
2022
;
Wang
et
al
., 2021
)
. Este
proceso conduce a una producción acelerada de ácido láctico, lo que reduce rápidamente el pH
y
genera un ambiente altamente selectivo que inhibe microorganismos competidores,
consolidando así la dominancia de las BAL
(
Pazos
-
Rojas
et al.
,
2023
.
En contraste, la inclusión de alfalfa en los tratamientos introduce limitaciones bioquímicas y
fisiológicas
que afectan negativamente la proliferación de las BAL
(Gao
et
al
., 2021)
. La alfalfa
presenta una menor concentración de carbohidratos solubles y una mayor proporción de fibra
estructural, lo que reduce la disponibilidad inmediata de sustratos
fermentables. Esta restricción
energética limita la tasa de crecimiento específico de las BAL, afectando su capacidad para
establecerse rápidamente como microbiota dominante
(Zhao
et
al
., 2025)
. Como resultado, se
observa una disminución significativa en e
l recuento de BAL
tiene
una tendencia a valores aún
más bajos, evidenciando una respuesta dependiente de la proporción de leguminosa incorporada
(Tatli Seven
et
al
., 2021)
.
Adicionalmente, el elevado contenido proteico de la alfalfa confiere una alta capac
idad tampón
al sistema, lo que interfiere con la cinética de acidificación del ensilaje
(Lewis
et
al
., 2022)
. La
resistencia a la disminución del pH prolonga un entorno subóptimo para el crecimiento de las
BAL, ya que estas bacterias alcanzan su máxima efi
ciencia metabólica en condiciones
ligeramente ácidas
(Guo
et
al
., 2023)
. La persistencia de valores de pH más elevados durante
las fases iniciales favorece la competencia con otros grupos microbianos, reduciendo la eficiencia
ecológica de las BAL y limitan
do su expansión poblacional
(Ghaffari
et
al
., 2019)
.
La comunidad microbiana
evidencia una notable plasticidad metabólica, la cual puede
interpretarse como una estrategia adaptativa frente a las condiciones fluctuantes del ensilaje. La
predominancia de actividad ureásica en la mayoría de las cepas sugiere una activa participación
e
n el metabolismo del nitrógeno, específicamente mediante la hidrólisis de urea a amoníaco, lo
que contribuye al incremento del pH del medio
(Turner
et
al
., 2019)
. Este fenómeno es
particularmente relevante en sistemas con alta inclusión de alfalfa, donde l
a acumulación de
compuestos nitrogenados y la capacidad tampón favorecen la persistencia de condiciones
subóptimas para la acidificación, facilitando así la proliferación de microbiota no láctica
(Nascimento
et
al
., 2023)
.
La actividad catalasa positiva en
todas las cepas indica una elevada tolerancia al estrés oxidativo,
lo que sugiere que estos microorganismos poseen mecanismos eficientes para detoxificar
especies reactivas de oxígeno, como el peróxido de hidrógeno
(Stratton
et
al
., 2022)
. Esta
caracterís
tica es consistente con su naturaleza aerobia o facultativa, permitiéndoles mantenerse
metabólicamente activos durante las fases iniciales del ensilaje, cuando aún existe oxígeno
residual
(Warzée
et
al
., 2021)
. En este contexto, la presencia de catalasa re
presenta una ventaja
competitiva frente a bacterias estrictamente anaerobias, como muchas BAL, las cuales carecen
de este sistema enzimático
(Ariete
et al
., 2021)
.
En relación con la actividad amilásica
, su presencia en la mayoría de las cepas sugiere una
capacidad funcional para hidrolizar polisacáridos complejos, como el almidón, generando
azúcares fermentables que pueden ser utilizados tanto por estas bacterias como por otros
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microorganismos presentes
en el sistema
(Cheng
et
al
., 2020)
. Este proceso puede alterar la
dinámica de disponibilidad de sustratos en el ensilaje, favoreciendo la proliferación de
comunidades microbianas no deseadas y generando competencia directa con las bacterias ácido
lácticas
por recursos energéticos limitados
(Górecki
et
al
., 2021)
.
Por otra parte, la tinción de Gram negativa observada en todas las cepas analizadas contrasta
con el perfil clásico de las bacterias ácido lácticas, que son típicamente Gram
-
positivas
(Sorrentino
et
al
., 2023)
. Este resultado sugiere que los microorganismos aislados corresponden
a grupos bacterianos distintos, posiblemente pertenecientes a géneros aerobios o facultativos
como Enterobacteriaceae u otros bacilos Gram
-
negativos asociados a procesos de deterioro
(D
auptain
et
al
., 2020)
. Esta composición microbiana indica una desviación del perfil fermentativo
ideal, donde las BAL deberían predominar, y pone en evidencia la influencia del sustrato y las
condiciones fisicoquímicas en la selección microbiana
(Jaspers
e
t
al
., 2020)
.
En el caso de los mohos y levaduras, la alta frecuencia de actividad ureásica y catalasa positiva
refleja una notable capacidad de adaptación a condiciones aeróbicas y a ambientes con
disponibilidad de nitrógeno
(Wang
et
al
., 2020)
. La produc
ción universal de amilasa en estas
cepas sugiere un rol activo en la degradación de compuestos estructurales, lo que puede
incrementar la disponibilidad de azúcares simples, pero también favorecer procesos de deterioro
secundario
(Xu
et
al
., 2022)
. La vari
abilidad observada en la tinción de Gram, aunque no es un
criterio taxonómico determinante para estos microorganismos, indica heterogeneidad estructural
en sus paredes celulares, lo que podría estar asociado a diferencias en resistencia ambiental y
activid
ad metabólica
(Martins
et
al
., 2021)
.
5.
Conclusiones
La caracterización microbiana evidenció mayores recuentos de bacterias ácido lácticas en T1
(100 % maíz), T2 (5 % alfalfa) y T3 (10 % alfalfa), asociados con una fermentación más eficiente
y mayor
estabilidad del ensilaje. Por el contrario, T4 (15 % alfalfa) presentó predominio de
aerobios mesófilos, mohos y levaduras, lo que indica menor estabilidad aeróbica. En
consecuencia, se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alternativa, dado q
ue al
menos uno de los niveles de inclusión de alfalfa (5 %, 10 % o 15 %) produjo diferencias
estadísticamente significativas (p < 0,05) en la composición microbiana.
La dinámica poblacional mostró que inclusiones de alfalfa ≤10 % (T2 y T3) promovieron un
crecimiento logarítmico más eficiente de las bacterias ácido lácticas y mantuvieron un perfil
microbiano equilibrado, mejorando la conservación del material ensilado. Sim embargo, T1 (100
% maíz) y T4 (15 % alfalfa) exhibieron menor dominancia de bacterias
ácido lácticas y menor
estabilidad fermentativa.
La producción de metabolitos evidenció que T3 (10 % alfalfa) registró la mayor concentración de
ácido acético, favorable para la estabilidad aeróbica, mientras que T2 (5 % alfalfa) presentó la
mayor producc
ión de etanol. T1 (100 % maíz) y T4 (15 % alfalfa) mostraron valores intermedios.
Por lo tanto, inclusiones moderadas de alfalfa entre 5 % y 10 % optimizan el equilibrio entre
fermentación láctica, eficiencia energética y conservación del forraje.
Contribu
ción de los autores:
Conceptualización, DDGA y AVCM; metodología, DDGA
,
MACA
y JEVN
software, IFEG
, CLNM;
validación, DDGA y AVCM; análisis formal, DDGA; investigación,
DDGA
y
AVCM
; recursos, IFEG
, CLNM y
AVCM; redacción del borrador original, DDGA
,
MACA
,
redacción, revisión y edición, DDGA y AVCM; visualización, IFEG
, JEVN
; supervisión, AVCM.
Financiamiento:
Esta investigación no ha recibido financiación externa
Agradecimientos:
Queremos expresar nuestro más sincero agradecimiento a la
Universidad
Técnica Estatal de Quevedo (UTEQ) por su apoyo invaluable durante el desarrollo de este
estudio. Agradecemos a los docentes, investigadores y al personal administrativo por brindar los
recursos necesarios, el acompañamiento y la infraestructura
adecuada para llevar a cabo este
trabajo. Su compromiso con la formación académica y la investigación ha sido fundamental para
el éxito de este proyecto. Asimismo, extendemos nuestro reconocimiento a la Secretaría de
Educación Superior, Ciencia, Tecnologí
a e Innovación (SENESCYT) de Ecuador por la beca
otorgada, la cual ha contribuido significativamente al desarrollo de esta investigación.
Animals: An Open Access
Journal From MDPI
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T
alanta
F
ood & Function
B
ioresource
Technology
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Bacteriology
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ioresource Technology
3
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griculture
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rontiers in Microbiology
T
he Science of the
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