H orizon Nexus Journal | Vol . 0 3 | Núm . 0 2 | Abr Jun | 202 5 | www.horizonnexusjournal.editorialdoso.com ISSN: 3073 - 1275 18 Articulo Potencial de Trichoderma spp como agente antagonista de Phytophthora palmivora en plántulas de cacao variedad CCN - 51 Potential of Trichoderma spp. as an Antagonistic Agent against Phytophthora palmivora in CCN - 51 Cocoa Seedlings Ángel Virgilio Cedeño Moreira 1 , * , César Fabián Varas Beltrán 2 , Ítalo Fernando Espinoza Guerra 3 , * , Camilo Alexander Mestanza Uquillas 4 , Ketty Vanessa Arellano Ibarra 5 , Odalis Celine Vilela Sabando 6 1 Universidad Técnica Estatal de Quevedo , Ecuador , Quevedo ; https://orcid.org/0000 - 0002 - 6564 - 5569 2 Universidad Técnica Estatal de Quevedo, Ecuador, Quevedo ; https://orcid.org/0000 - 0002 - 1885 - 5977 ; cvarasb@uteq.edu.ec 3 Universidad Técnica Estatal de Quevedo, Ecuador, Quevedo ; https://orcid.org/0000 - 0002 - 2975 - 3087 4 Universidad Técnica Estatal de Quevedo , Ecuador , Quevedo ; https://orcid.org/0000 - 0001 - 9299 - 170X ; cmestanza@uteq.edu.ec 5 Universidad Técnica Estatal de Quevedo , Ecuador , Quevedo ; https://orcid.org/0000 - 0001 - 7168 - 7485 ; ketty.arellano2017@uteq.edu.ec 6 Universidad Técnica Estatal de Quevedo, Ecuador, Quevedo; https://orcid.org/0009 - 0004 - 0949 - 3646 ; ovilelas@uteq.edu.ec * Correspondencia: acedenom@uteq.edu.ec ; iespinoza@uteq.edu.ec https://doi.org/10.70881/hnj/v3/n2/58 Resumen: Phytophthora palmivora es un patógeno devastador en cultivos de cacao, que causa enfermedades como la podredumbre de la vaina y la pudrición de la raíz, afectando significativamente la productividad y calidad de los cultivos. Dado que el control químico presenta desafíos debido a la resistencia del patógeno y sus efectos ambientales, el control biológico mediante hongos como Trichoderma harzianum se presenta como una alternativa prometedora. Este estudio evaluó el potencial de tres cepas de Trichoderma (TCH - 01, TCH - 22, TCH - 09) c omo agentes biocontroladores de P. palmivora en plántulas de cacao variedad CCN - 51. Se realizaron evaluaciones de crecimiento radial de las cepas, inhibición del crecimiento y esporulación de P. palmivora in vitro , así como de la incidencia y severidad de la enfermedad en las plántulas tratadas. Los resultados mostraron que TCH - 01 fue la cepa más eficaz, logrando una inhibición del crecimiento de P. palmivora del 80% y una inhibición de la esporulación del 96%, lo que fue significativamente superior a las o tras cepas. En las plántulas de cacao, TCH - 01 también presentó la menor incidencia (10%) y severidad (20%) de la enfermedad, en comparación con los controles. Estos resultados demuestran que TCH - 01 tiene un alto potencial para ser utilizado como biocontrol ador de P. palmivora , contribuyendo a estrategias de manejo más sostenibles y reduciendo la dependencia de tratamientos químicos en el cultivo de cacao. Palabras clave: B iocontrol, cacao, incidencia, severidad, inhibición Cita: Cedeño Moreira, Ángel V., Varas Beltrán, C. F., Espinoza Guerra, Ítalo F., Mestanza Uquillas, C. A., Arellano Ibarra, K. V., & Vilela Sabando, O. C. (2025). Potencial de Trichoderma spp como agente antagonista de Phytophthora palmivora en plántulas de cacao varie dad CCN - 51. Horizon Nexus Journal , 3 (2), 18 - 35. https://doi.org/10.70881/hnj/ v3/n2/58 Recibido: 04 / 04 /20 25 Revisado: 24 / 04 /20 25 Aceptado: 25 / 04 /20 25 Publicado: 30 / 04 /20 25 Copyright: © 202 5 por los autores . Este artículo es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos y condiciones de la Licencia Creative Commons, Atribución - NoComercial 4.0 Internacional. ( CC BY - NC ) . ( https://creativecommons.org/lic enses/by - nc/4.0/ )
Horizon Nexus Journal Horizon Nexus Journal | Vol.0 3 | Núm 0 2 | Abr Jun | 20 25 | www.horizonnexusjournal.editorialdoso.com 19 Abstract: Phytophthora palmivora is a devastating pathogen in cocoa crops, causing diseases such as pod rot and root rot, significantly affecting productivity and quality. Since chemical control poses challenges due to the pathogen's resistance and environmental impacts, biological contr ol through fungi such as Trichoderma harzianum emerges as a promising alternative. This study evaluated the potential of three Trichoderma strains (TCH - 01, TCH - 22, TCH - 09) as biocontrol agents against P. palmivora in CCN - 51 cocoa seedlings. Radial growth e valuations of the strains, as well as growth inhibition and sporulation of P. palmivora in vitro , were conducted, along with assessments of disease incidence and severity in the treated seedlings. The results showed that TCH - 01 was the most effective strai n, achieving 80% growth inhibition of P. palmivora and 96% inhibition of sporulation, significantly outperforming the other strains. In the cocoa seedlings, TCH - 01 also showed the lowest incidence (10%) and severity (20%) of the disease, compared to the co ntrols. These results demonstrate that TCH - 01 has high potential to be used as a biocontrol agent for P. palmivora , contributing to more sustainable management strategies and reducing reliance on chemical treatments in cocoa cultivation. Keywords: Biocont rol, cocoa, incidence, severity, inhibition 1. Introducción La variedad de cacao CCN - 51 (Colección Castro Naranjal 51) se ha consolidado como una de las más importantes a nivel agronómico y económico por su alta productividad, rápida entrada en producción y moderada tolerancia a enfermedades como la moniliasis ( Moniliophthora roreri ) y la escoba de bruja ( Moniliophthora perniciosa ), lo que ha favorecido su adopción en sistemas de producción a gran escala ( Stagnati et al., 2020; Amores, 2024 ) . No obstante, en los últimos años, diversos estudios y reportes de campo han evidenciado una creciente susceptibilidad de esta variedad a Phytophthora spp. , agente causal de la pudrición negra del fruto, lo que representa una amenaza significativa para su sostenibilidad comercial ( Cedeño et al., 2020) . En este contexto, el presente estudio seleccionó a la variedad CCN - 51 como modelo experimental con el fin de evaluar la eficacia de cepas antagonistas del género Trichoderma como estrategia biológica para el control de Phytophthora , contribuyendo así al manejo integrado de enfermedades en el cultivo de cacao. Varios estudios han demostrado que Phytophthora palmivora es un patógeno que afecta significativamente a diversas especies vegetales, siendo especialmen te devastador en cultivos de cacao ( Theobroma cacao ), donde causa enfermedades como la podredumbre de la vaina y la pudrición de la raíz (Simamora et al., 2021) . Estas infecciones conducen a una disminución en la productividad, calidad y rendimiento de los cultivos, lo que representa un desafío importante para los productores de cacao a nivel mundial (Misman, et al., 2022; Puig et al., 2021) . A pesar de los esfuerzos por desarrollar métodos efectivos para el control de esta enfermedad, el manejo de P. palmi vora sigue siendo complicado debido a su capacidad para producir esporas resistentes y su amplia dispersión en condiciones favorables de humedad y temperatura (Balanagouda et al., 2021) . En este contexto, el control biológico se presenta como una alternati va prometedora para reducir la dependencia de fungicidas químicos, los cuales no solo son costosos, sino que también contribuyen a la resistencia de los patógenos y afectan negativamente al medio ambiente (Fenta y Mekonnen, 2024) . Uno de los agentes biocon troladores más estudiados y utilizados en la lucha contra diversos patógenos fúngicos es el hongo
Horizon Nexus Journal Horizon Nexus Journal | Vol.0 3 | Núm 0 2 | Abr Jun | 20 25 | www.horizonnexusjournal.editorialdoso.com 20 Trichoderma harzianum , que ha demostrado poseer una amplia gama de mecanismos antagonistas, como la competencia por nutrientes, la producción de compuestos an timicrobianos y la inducción de resistencia en las plantas hospedadoras (Poveda, 2021; Manzar et al., 2022) . Diversos estudios han señalado la capacidad de Trichoderma para suprimir el crecimiento de Phytophthora spp., lo que sugiere que las cepas de Trich oderma podrían ser una herramienta eficaz en el manejo integrado de enfermedades fúngicas en cacao (Sarria et al., 2021) . Sin embargo, a pesar de los resultados prometedores, la efectividad de las cepas de Trichoderma puede variar dependiendo de factores como la cepa utilizada, las condiciones ambientales y la etapa de desarrollo de la planta (Ferreira y Musumeci, 2021) . Por lo tanto, es crucial realizar estudios más profundos que comparen las diferentes cepas de Trich oderma en condiciones controladas para identificar aquellas con el mayor potencial de biocontrol frente a P. palmivora . Entre las especies más destacadas de Trichoderma se encuentran Trichoderma harzianum (Khoiri et al., 2023 ) , Trichoderma koningiopsis ( Za pata y Botina , 2023) y Trichoderma viride (Putra et al., 2022 ), las cuales han mostrado un alto potencial antagonista mediante mecanismos como la competencia por espacio y nutrientes, la producción de metabolitos antifúngicos y la micoparasitación directa ( Sukorini et al., 2021) . Estudios realizados en condiciones in vitro e in vivo han confirmado su capacidad para reducir significativamente la incidencia y severidad de la pudrición negra del fruto, convirtiéndolas en alternativas viables y sostenibles dentro del manejo integrado de enfermedades ( Sirikamonsathien et al., 2023) . Los m etabolitos producidos por Trichoderma desempeñan un papel crucial en su capacidad para inhibir el crecimiento de patógenos como Phytophthora palmivora . Estos metabolitos incluyen una variedad de compuestos bioactivos que tienen efectos antifúngicos, antiba cterianos y antimicrobianos, lo que les permite actuar como herramientas eficaces en el biocontrol de enfermedades de plantas (Ayyandurai et al., 2024; Shahriar et al., 2022). Entre los principales metabolitos antimicrobianos de Trichoderma se encuentran l as trichoderminas, peptaiboles, lactonas y proteínas hidrolíticas (Nakkeeran et al., 2021; Alfaro et al., 2022). El objetivo principal de este estudio fue identificar qué cepa de Trichoderma presenta el mayor potencial para ser utilizada como biocontrolado r de P. palmivora en cacao, evaluando tanto su efectividad directa sobre el patógeno como su impacto en la reducción de los síntomas de la enfermedad en las plantas hospedadoras. La información obtenida de este trabajo contribuirá a la implementación de pr ácticas agrícolas más sostenibles y eficaces para el manejo de P. palmivora , reduciendo la dependencia de químicos y promoviendo el uso de agentes biológicos naturales. En este contexto, el presente estudio no solo busca aportar soluciones efectivas al man ejo de Phytophthora palmivora en cacao, sino también contribuir a los Objetivos de Desarrollo Sostenible, en particular al ODS 12 (Producción y Consumo Responsables) y al ODS 13 (Acción por el Clima). La incorporación de cepas de Trichoderma como alternati va biológica al uso de fungicidas químicos promueve prácticas agrícolas más sostenibles, con un menor impacto ambiental, beneficiando especialmente a pequeños productores, programas de manejo integrado y sistemas agroecológicos orientados a la sostenibilid ad.
Horizon Nexus Journal Horizon Nexus Journal | Vol.0 3 | Núm 0 2 | Abr Jun | 20 25 | www.horizonnexusjournal.editorialdoso.com 21 2. Materiales y Métodos Aislamiento de las cepas de Trichoderma Las cepas de Trichoderma fueron aisladas a partir de muestras de suelo recolectadas de plantaciones de cacao de más de 20 años de edad, que no habían recibido intervención química en los últimos años. Las muestras se obtuvieron de suelos de plantaciones con antecedentes de infecc ión por Phytophthora palmivora , un patógeno común en estos cultivos. El aislamiento de las cepas se realizó mediante el método de dilución en serie, utilizando placas de agar PDA (Papa Dextrosa Agar) para favorecer el crecimiento de hongos saprófitos. Las muestras de suelo fueron procesadas en condiciones asépticas para evitar la contaminación con otros microorganismos. Posteriormente, las placas se incubaron a 25°C durante un período de 5 a 7 días, lo que permitió el desarrollo de las colonias fúngicas. La s colonias de Trichoderma fueron seleccionadas en función de su morfología característica, como la presencia de estructuras de conidios en forma de esporas y un micelio blanco algodonoso, que son indicadores típicos de este género. Extracción de ADN Se uti lizó el kit comercial GeneJET Genomic DNA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) para la extracción de ADN genómico de las cepas seleccionadas. El ADN fue extraído siguiendo las instrucciones del fabricante, con modificaciones mínimas para optimizar el rendimiento. La calidad y concentración del ADN extraído fueron evaluadas utilizando un espectrofotómetro (NanoDrop 2000, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Amplificación de la región ITS Para la identificación molecular, se amplificó la región del e spaciador interno transcrito (ITS) del ADN ribosómico utilizando los cebadores ITS1 5' - TCCGTAGGTGAACCTGCGG - 3' e ITS4 5' - TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3' , que son ampliamente utilizados para la identificación de hongos en estudios filogenéticos. La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 25 µL, que contenía 12.5 µL de Taq Master Mix (Thermo Fisher Scientific), 1 µL de cada cebador (10 µM), 2 µL de ADN templado, y 8.5 µL de agua ultrapura. Las condiciones del ciclo de PCR fueron las siguientes: 95°C durante 3 minutos (desnaturalización inicial), seguido de 35 ciclos de 95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos (hibridación), y 72°C por 1 minu to, con una extensión final a 72°C durante 5 minutos. Purificación y secuenciación Los productos de PCR fueron purificados utilizando el kit GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Fisher Scientific) y enviados a un servicio de secuenciación comercial (Macrog en, Seúl, Corea) para obtener las secuencias en ambas direcciones. Análisis filogenético y comparación de secuencias Las secuencias obtenidas fueron procesadas y analizadas utilizando el software ChromasPro (Technelysium, Australia) para la alineación y e dición de las secuencias. Posteriormente, las secuencias fueron comparadas con las disponibles en la base de datos GenBank utilizando la herramienta BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para determinar la identidad de las cepas. La identidad y la cobertura de la secuencia se calcularon en función de la comparación con las secuencias de referencia de Trichoderma .
Horizon Nexus Journal Horizon Nexus Journal | Vol.0 3 | Núm 0 2 | Abr Jun | 20 25 | www.horizonnexusjournal.editorialdoso.com 22 Construcción del dendrograma filogenético Para evaluar las relaciones filogenéticas entre las cepas aisladas de Trichoderma y otras es pecies del género, se realizó un análisis filogenético utilizando el método de Máxima Verosimilitud en el software MEGA X. Se seleccionó el modelo de sustitución más adecuado (Tamura - Nei) basado en los resultados del ModelTest y se calculó el soporte de lo s nodos utilizando el método de Bootstrap con 1000 réplicas. El dendrograma resultante se utilizó para visualizar la relación filogenética de las cepas de Trichoderma en este estudio. Velocidad de crecimiento La velocidad de crecimiento radial de las cepa s de Trichoderma ( TCH - 01 , TCH - 22 , TCH - 09 ) se evaluó mediante el cultivo de las cepas en medio de agar PDA (Papa Dextrosa Agar). Se inocularon discos de 5 mm de diámetro de cada cepa, extraídos de colonias en crecimiento, en el centro de placas de Petri est ériles de 9 cm de diámetro. Las placas se incubaron a 25°C durante 24, 48 y 72 horas. El crecimiento radial se midió en dos direcciones perpendiculares en cada placa, y se calculó el diámetro promedio de las colonias en cada intervalo de tiempo. Las medici ones se realizaron en triplicado para cada cepa y cada intervalo de tiempo, y se utilizó un control negativo (placas sin inocular) para verificar la ausencia de contaminación. Los datos obtenidos fueron analizados utilizando un análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba de Tukey ( p < 0.05) para determinar las diferencias significativas en el crecimiento radial entre las diferentes cepas a los distintos tiempos de evaluación. Evaluación de inhibición in vitro La inhibición in vitro del crecimiento de Phytophthora palmivora por las cepas de Trichoderma ( TCH - 01 , TCH - 22 , TCH - 09 ) se evaluó utilizando el método de confrontación directa en placas de agar PDA. Se prepararon placas de Petri de 9 cm de diámetro con medio agar PDA estéril. Un disco de 5 mm de diámetro de una colonia de P. palmivora cepa VPP 44 correspondiente al banco de cepas de la UTEQ fue colocado en el centro de cada placa. Posteriormente, se inoculó un disco de 5 mm de diámetro de cada cepa de Trichoderma a una distancia de 2 cm del disco de P. palmivora . Las placas fueron incubadas a 25°C en condiciones controladas durante 7 días . La inhibición del crecimiento de P. palmivora se evaluó midiendo el diámetro del crecimiento de la colonia de P. palmivora en las placas. La in hibición se calculó como el porcentaje de reducción en el crecimiento radial de P. palmivora en presencia de Trichoderma , en comparación con el crecimiento en las placas de control (sin Trichoderma ). Las mediciones se realizaron en triplicado para cada tratamiento y se incluyó un control negativo (placa con P. palmivora sin Trichoderma ). Los datos obtenidos fueron analizados utilizando un análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey ( p < 0.05) par a determinar las diferencias significativas entre las cepas de Trichoderma en su capacidad para inhibir el crecimiento de P. palmivora . Inhibición de la infección en plántulas La evaluación de la inhibición de Phytophthora palmivora en plántulas de cacao se realizó mediante un bioensayo en condiciones controladas utilizando plántulas de cacao variedad CCN - 51, las cuales fueron tratadas con suspensiones de conidios de las cepas de Trichoderma (TCH - 01, TCH - 22, TCH - 09) y posteriormente inoculadas con zoospor as de P. palmivora. Se aplicaron 10 mL de la suspensión de Trichoderma en las hojas jóvenes de las plántulas y, 24 horas después, se inoculó con la suspensión de
Horizon Nexus Journal Horizon Nexus Journal | Vol.0 3 | Núm 0 2 | Abr Jun | 20 25 | www.horizonnexusjournal.editorialdoso.com 23 zoosporas. La incidencia de la enfermedad se calculó semanalmente durante 4 semanas como el po rcentaje de plantas infectadas con síntomas visibles, mientras que la severidad se evaluó utilizando la escala visual de Gonzáles y Pérez (2021), considerando el porcentaje de la hoja afectada. Se incluyó un control negativo sin tratamiento y sin inoculaci ón. Los resultados fueron analizados mediante ANOVA y la prueba de Tukey ( p < 0.05) para identificar diferencias significativas entre los tratamientos y el control. 3. Resultados Identificación molecular Los resultados demostraron que todos los aislamientos corresponden al género Trichoderma , confirmando la correcta clasificación genética de las cepas aisladas. La cepa T14, identificada como Trichoderma koningiopsis , mostró una cobertura de consulta del 10 0% y una identidad del 100% con el número de acceso GenBank MG266013.1 . La cepa TH - 01, correspondiente a Trichoderma harzianum , presentó también una cobertura del 100%, con una id entidad del 99%, y se encuentra registrada con el número de acceso OM078502.1 . Finalmente, la cepa ZNWPL9, también de Trichoderma harzianum , alcanzó una cobertura de consulta del 100% y una identidad del 100%, con el número de acceso KR868395.1 . Tabla 1. Identificación molecular de los aislamientos de Trichoderma mediante comparación con secuencias de referencia en la base de datos NCBI/GenBank. AISLADO Identidad (Base de datos NCBI / GenBank) Código Nomenclatura Cepa Cobertura de consulta (%) Identidad (%) Numero de acceso TCH - 01 Trichoderma koningiopsis T14 100 100 MG266013.1 TCH - 22 Trichoderma harzianum TH - 01 100 99 OM078502.1 TCH - 09 Trichoderma harzianum ZNWPL9 100 100 KR868395.1 Relación filogenética El dendrograma obtenido muestra la relación filogenética entre diversas cepas de Trichoderma y Phytophthora infestans (Figura 1). Se observa una clara separación entre los dos géneros, con las cepas de Trichoderma agrupándose en dos grandes clústeres: uno correspondiente a Trichoderma harzianum y otro a Trichoderma koningii . Dentro del clúster de Trichoderma harzianum , las cepas Trichoderma harzianum 1 , Trichoderma harzianum 2 y Trichoderma harzianum 3 se agrupan e strechamente, con un valor de bootstrap de 100%, lo que indica una alta confianza en su relación. Por otro lado, la cepa THC - 09 se separa de este grupo con un valor de bootstrap del 80%, lo que sugiere una divergencia significativa respecto a las otras cep as de T. harzianum .
Horizon Nexus Journal Horizon Nexus Journal | Vol.0 3 | Núm 0 2 | Abr Jun | 20 25 | www.horizonnexusjournal.editorialdoso.com 24 Asimismo, la cepa THC - 22 también se agrupa con alta confiabilidad (100%) con las otras cepas de T. harzianum . El segundo clúster, correspondiente a Trichoderma koningii , muestra una clara subdivisión entre las cepas Trichoderma koningii 1 , Trichoderma koningii 2 y Trichoderma koningii 3 . Las cepas THC - 01 y THC - 01 también se incluyen en este grupo, con valores de bootstrap del 90% y 80%, respectivamente, lo que indica una buena separación dentro del grupo. Finalmente, la cepa de Phytophth ora infestans se agrupa en un clúster completamente separado de las cepas de Trichoderma , lo que refleja la divergencia genética entre estas dos especies . Figura 1. Dendrograma basado en un análisis filogenético de las cepas de Trichoderma y Phytophthora infestans utilizando datos moleculares. El árbol muestra las relaciones evolutivas entre las siguientes cepas de Trichoderma : Trichoderma harzianum 1 , Trichoderma harzianum 2 , Trichoderma harzianum 3 , THC - 09 , THC - 22 , Trichoderma koningii 1 , Tr ichoderma koningii 2 , Trichoderma koningii 3 , y THC - 01 . Phytophthora infestans 1 se muestra como un grupo distinto. Velocidad de crecimiento El crecimiento radial de las cepas de Trichoderma ( TCH - 01 , TCH - 22 , TCH - 09 ) fue evaluado durante tres intervalos de tiempo (24, 48 y 72 horas) para determinar su capacidad de expansión en condiciones controladas (Figura 1) . Los resultados obtenidos muestran un patrón de crecimiento progresivo, con un aumento significativo en el diámetro del crecimiento rad ial a medida que transcurría el tiempo de incubación.
Horizon Nexus Journal Horizon Nexus Journal | Vol.0 3 | Núm 0 2 | Abr Jun | 20 25 | www.horizonnexusjournal.editorialdoso.com 25 A las 24 horas, las cepas mostraron un crecimiento moderado, con valores de 1.23 cm para TCH - 01 , 1.18 cm para TCH - 22 y 1.09 cm para TCH - 09 . Estos resultados indican que las tres cepas iniciaron su creci miento de manera similar en el primer periodo de observación, sin diferencias significativas entre ellas. Sin embargo, a las 48 horas, se observó un aumento sustancial en el crecimiento de todas las cepas. En este intervalo, TCH - 22 mostró el mayor aumento, alcanzando 2.83 cm, seguido por TCH - 01 con 2.60 cm y TCH - 09 con 2.19 cm. A las 72 horas, el crecimiento continuó incrementándose de manera notable, alcanzando 4.57 cm para TCH - 22 , 4.49 cm para TCH - 01 y 4.11 cm para TCH - 09 . TCH - 22 presentó consistentement e los mayores valores de crecimiento a lo largo de todos los periodos, lo que sugiere que esta cepa podría tener una tasa de crecimiento más rápida en comparación con las otras cepas estudiadas. Figura 2. Crecimiento radial de las cepas Trichoderma ( TCH - 01 , TCH - 22 , TCH - 09 ) en función del tiempo (24, 48 y 72 horas). Los valores representan el crecimiento en centímetros (cm) y se muestran como la media ± error estándar. Las letras indican diferencias significativas entre las cepas, según el análisis de varian za (ANOVA) seguido de la prueba de Tukey (p < 0.05). Inhibición in vitro En la evaluación de la inhibición del crecimiento de Phytophthora palmivora ( Figura 3 A), se observó que todas las cepas de Trichoderma evaluadas mostraron una capacidad significativa para reducir el crecimiento del patógeno. La cepa TCH - 01 fue la más efectiva, con una inhibición del crecimiento de aproximadamente 8 0 %, que fue significativamente superior a las otras cepas. En contraste, T CH - 22 y TCH - 09 presentaron inhibiciones del 67 % y 70 %, respectivamente. El análisis estadístico (prueba de Tukey) indicó diferencias significativas entre las cepas, siendo TCH - 01 significativamente más eficaz que TCH - 22 y TCH - 09 ( p < 0.05) . En cuanto a la inhibición de la esporulación de P. palmivora ( Figura 3 B), los resultados mostraron que TCH - 01 inhibió la esporulación, alcanzando un 96 %, lo que sugiere una capacidad excepcional para suprimir la formación de esporangios. Por otro lado, TCH - 22 mostró una inhibición del 6 0%, mientras que TCH - 09 presentó la menor capacidad a ab a a a a a b b 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 24 horas 48 horas 72 horas Crecimiento (cm) Tiempo (Horas) TCH-01 TCH-22 TCH-09
Horizon Nexus Journal Horizon Nexus Journal | Vol.0 3 | Núm 0 2 | Abr Jun | 20 25 | www.horizonnexusjournal.editorialdoso.com 26 con una inhibición de solo el 20%. Las diferencias entre las cepas fueron estadísticamente significativas ( p < 0.05), como se indica con las letras "a", "b", y "c", donde TCH - 01 resultó s er más eficaz en la inhibición de la esporulación en comparación con TCH - 22 y TCH - 09 . Figura 3. Inhibición del crecimiento y la esporulación de Phytophthora palmivora por cepas de Trichoderma ( TCH - 01 , TCH - 22 , TCH - 09 ). Panel A: Inhibición del crecimiento de P. palmivora por las cepas de Trichoderma . Panel B: Inhibición de la esporulación de P. palmivora por las cepas de Trichoderma . Los valores representan la media ± error estándar de tres repeticiones. Las letras " i ndican diferencias significativas entre las cepas, según el análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba de Tukey ( p < 0.05). Inhibición de la infección en plántulas En la Figura 4 se presentan los resultados de la infección de Phytophthora palmivora en plantas de cacao tratadas con diferentes cepas de Trichoderma ( TCH - 01 , TCH - 22 , TCH - 09 ) y un grupo control (testigo). Se evaluaron dos parámetros: incidencia y severidad de la enfermedad. En términos de incidencia, el tratamiento c on TCH - 01 presentó el menor porcentaje de infección (10%), seguido de TCH - 22 y TCH - 09 , con incidencias de aproximadamente 33% y 12%, respectivamente. El testigo mostró la mayor incidencia, alcanzando un 60%. En cuanto a severidad, el tratamiento con TCH - 01 también mostró el menor porcentaje (20%), mientras que TCH - 22 y TCH - 09 presentaron severidades de 45% y 29%, respectivamente. Mientras que el testigo mostró la mayor severidad con un 76%. Figura 4. Infección de Phytophthora palmivora en plantas de cacao tratadas con diferentes cepas de Trichoderma ( TCH - 01 , TCH - 22 , TCH - 09 ) y un testigo (sin tratamiento). Se muestra el porcentaje de incidencia (barras grises) y severidad (barras negras) de la enfermedad en cada tratamiento. Los valores son expresados como l a media ± error estándar. Las letras indican diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos, según el análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba de Tukey ( p < 0.05). a b b 0 20 40 60 80 100 TCH-01 TCH-22 TCH-09 Inhibición (%) crecimiento Cepas a b c 0 20 40 60 80 100 120 TCH-01 TCH-22 TCH-09 Inhibición (%) esporulacíon Cepas A B
Horizon Nexus Journal Horizon Nexus Journal | Vol.0 3 | Núm 0 2 | Abr Jun | 20 25 | www.horizonnexusjournal.editorialdoso.com 27 4. Discusión En un estudio realizado por Woo et al. (2023) se señaló que Trichoderma se encuentra de manera natural en suelos agrícolas debido a su habilidad para competir con otros microorganismos por nutrientes y su capacidad para descomponer materia orgánica. Además, Awad et al. (2022) expresa qu e Trichoderma forma parte del microbiota del suelo, especialmente en suelos que no han recibido tratamiento químico durante largos períodos, como las plantaciones de cacao en este estudio, lo que favorece la presencia y proliferación de estos hongos. Las p lantaciones de cacao, que son suelos ricos en materia orgánica debido a la caída constante de hojas y frutos, proporcionan un ambiente ideal para que las especies de Trichoderma se desarrollen, ya que este género de hongos se alimenta principalmente de res iduos orgánicos y residuos de otros microorganismos (Delgado et al., 2021) . Asimismo, en suelos con antecedentes de infección por Phytophthora palmivora , como en este estudio, las cepas de Trichoderma pueden prevalecer debido a su habilidad para actuar com o antagonistas biológicos, competiendo directamente con P. palmivora por recursos y espacio, e inhibiendo su crecimiento mediante la producción de compuestos antimicrobianos (Thomas et al., 2024; Modrzewska et al., 2022) . De acuerdo con Bustamante et al. ( 200 1 ), la identificación de cepas específicas de Trichoderma en suelos de cacao puede estar relacionada con la adaptación de estas cepas a las condiciones particulares del cultivo. Por ejemplo, TCH - 01 , TCH - 22 , y TCH - 09 podrían tener características que les permitan prosperar en los suelos del cacao, como una mayor resistencia a las condiciones de humedad alta y una capacidad más eficiente para colonizar el rizósfera del cacao, lo cual les permite establecerse y competir con otros patógenos presentes en el suelo. D iversos estudios, demuestran que el patrón de crecimiento observado en las cepas de Trichoderma a lo largo del tiempo puede ser explicado a partir de la fisiología de los hongos y su interacción con el medio ambiente (Cabral et al., 2022) . La fase de adaptación inicial, con un crecimiento moderado a las 24 horas, es una respuesta típica de los hongo s al medio de cultivo, donde durante este período el hongo establece su micelio y ajusta sus mecanismos metabólicos a las condiciones de crecimiento ( Illescas et al., 20 21 ). En este sentido, la fase de crecimiento más lento al inicio se debe a la c b c a d b cd a 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 TCH-01 TCH-22 TCH-09 Testigo Infección (%) Tratamientos Severidad Incidencia
Horizon Nexus Journal Horizon Nexus Journal | Vol.0 3 | Núm 0 2 | Abr Jun | 20 25 | www.horizonnexusjournal.editorialdoso.com 28 necesidad del hongo de adaptarse al nuevo entorno, sin embargo, una vez establecido, Trichoderma experimenta una fase de expansión rápida debido a su alta eficiencia en la absorción de nutrientes y su capacidad para competir con otros microorganismos ( Kumar et al., 20 23 ). La observación de un crecimiento más pronunciado a las 48 horas, especialmente para TCH - 22 , podría explicarse por la capacidad de esta cepa para utilizar los recursos disponibles de manera más eficiente. Estudios previos han demostrado que Trichode rma puede inducir la producción de enzimas extracelulares, como celulasas y quitinasas, que permiten la descomposición de los componentes del medio de cultivo, lo que facilita la expansión del hongo ( Asad, 2022; Mejía et al., 2021 ). La mayor producción de estas enzimas podría ser la causa del crecimiento más rápido en comparación con las otras cepas en este intervalo. Las especies Trichoderma harzianum y T. koningiopsis son reconocidas por su capacidad para producir metabolitos antifúngicos, como quitinasa s y peptaiboles, que les confieren una notable actividad antagónica contra fitopatógenos ( Kurchenko et al., 2023) . Estudios han demostrado que la producción de estos compuestos se incrementa durante las interacciones con hongos patógenos ( Sridharan et al., 2021) . Por ejemplo, se ha observado que T. harzianum aumenta la síntesis de ciertos metabolitos secundarios al enfrentarse a patógenos como Rhizoctonia solani y Botrytis cinerea . Asimismo, investigaciones sobre T. koningiopsis han reportado su eficacia en la inhibición del crecimiento de Fusarium solani , atribuida a la producción de enzimas hidrolíticas y otros compuestos antifúngicos ( Wang et al., 2023) . En términos de la variabilidad entre cepas, estudios como el de Xiao et a l. (20 23 ) indican que diferentes cepas de Trichoderma pueden mostrar diferentes tasas de crecimiento debido a factores genéticos. Algunas cepas tienen un mayor potencial de crecimiento debido a su capacidad para adaptarse a condiciones específicas del medi o de cultivo, como la concentración de nutrientes y la competencia con otros organismos. Esta variabilidad entre cepas es fundamental en los estudios de biocontrol, ya que las cepas más rápidas en crecimiento podrían tener ventajas competitivas para su uso en la lucha contra patógenos como Phytophthora palmivora ( Pedrero et al., 20 21 ). La capacidad de Trichoderma para inhibir el crecimiento y la esporulación de P. palmivora se ha atribuido a una combinación de factores, incluyendo la competencia por nutrien tes, la producción de metabolitos secundarios antimicrobianos y la inducción de respuestas de defensa en las plantas hospedadoras ( Lopes et al., 20 24 ; Poveda y Baptista , 20 21 ). En cuanto a la inhibición de la esporulación, la producción de compuestos antim icrobianos por Trichoderma también juega un papel importante. Algunos estudios han demostrado que Trichoderma puede interferir en la formación de esporas de patógenos, impidiendo la germinación o el desarrollo de estructuras reproductivas ( Alfiky y Weissko pf, 2021; Thangaraj et al., 2025 ). En este estudio, TCH - 01 inhibió un 96% de la esporulación de P. palmivora , lo que sugiere que esta cepa tiene un mecanismo más eficiente para suprimir la formación de esporangios. En contraste, las cepas TCH - 22 y TCH - 09 mostraron una inhibición menor, lo que indica que su capacidad para interferir en la esporulación es menos pronunciada, posiblemente debido a una menor producción de compuestos antimicrobianos o una capacidad reducida para colonizar el patógeno. La variabilidad en la eficacia de las cepas de Trichoderma observada en este estudio también puede estar relacionada con la genética de las cepas. Diferentes cepas de
Horizon Nexus Journal Horizon Nexus Journal | Vol.0 3 | Núm 0 2 | Abr Jun | 20 25 | www.horizonnexusjournal.editorialdoso.com 29 Trichoderma tienen diferentes capacidades para producir enzimas de degradación de la pared c elular (como quitinasas y celulasas), que podrían ser más efectivas contra algunos patógenos que otros ( Assis et al., 2024) Además, el análisis filogenético de las cepas de Trichoderma en estudios previos ha mostrado que las cepas de T. harzianum suelen se r más agresivas en sus interacciones con otros hongos debido a su capacidad para producir una amplia gama de metabolitos secundario ( Tyśkiewicz et al., 2022 ). En condiciones de campo, Trichoderma harzianum y T. koningiopsis han mostrado una notable capacid ad para inhibir patógenos asociados a los cultivo s , especialmente a patógenos causante d e enfermedades vasculares ( Caccavo et al., 2022; Luo et al., 2023) . Investigaciones ejecutadas por Santoyo et al. (2024) establecen que varias especies de Trichoderma se establecen eficientemente en el suelo y en la rizósfera, incluso en ambientes tropicales con alta humedad, lo que favorece su persistencia y eficacia biocontroladora. Sin embargo, Asghar et al. (2024) expresa que, a pesar de su demostrado potencial com o agente de control biológico, el uso de Trichoderma en aplicaciones de campo presenta algunas limitaciones que pueden afectar su eficacia. Por otra parte, Leuratti et al. (2025) demuestra que u na de las principales restricciones es la variabilidad de las condiciones ambientales, como la temperatura, humedad, pH del suelo y radiación solar, que pueden reducir la viabilidad y actividad del hongo tras su aplicación. Además, su eficacia puede disminuir en suelos con alta carga microbiana competitiva o contamin ados, donde la colonización por Trichoderma es menos eficiente ( Zhao et al., 2025) . Una de las principales limitaciones del presente estudio radica en que las evaluaciones se realizaron exclusivamente bajo condiciones controladas, tanto in vitro como en in vernadero, lo cual, si bien permite obtener resultados precisos y repetibles, no refleja completamente la complejidad de los agroecosistemas reales. Según estudios de Wu et al. (2022) f actores ambientales como la variabilidad climática, las interacciones m icrobiológicas del suelo y la dinámica propia del cultivo en campo pueden influir significativamente en la eficacia de las cepas de Trichoderma . Dugassa et al. (2021) recomienda que fundamental desarrollar ensayos en condiciones de campo abierto, que perm itan validar el comportamiento antagonista de T. harzianum y T. koningiopsis frente a Phytophthora palmivora , y así determinar su viabilidad como herramienta efectiva dentro de programas de manejo integrado en plantaciones comerciales de cacao. La interacc ión entre Trichoderma y el microbiota del suelo en sistemas cacaoteros representa un componente clave para el desarrollo de suelos supresivos, capaces de limitar naturalmente la proliferación de patógenos. Al introducir cepas de Trichoderma con actividad antagonista, no solo se inhibe directamente a agentes como Phytophthora palmivora , sino que también se modula positivamente la comunidad microbiana nativa, favoreciendo poblaciones benéficas y fortaleciendo los mecanismos de defensa del ecos istema edáfico. Esta relación simbiótica puede mejorar la disponibilidad de nutrientes, estimular el crecimiento radicular y reducir la dependencia de insumos químicos, promoviendo una salud integral del agroecosistema. Así, Trichoderma no solo actúa como un biocontrolador puntual, sino como un regulador ecológico que contribuye a la resiliencia y sostenibilidad de los sistemas agrícolas a largo plazo.
Horizon Nexus Journal Horizon Nexus Journal | Vol.0 3 | Núm 0 2 | Abr Jun | 20 25 | www.horizonnexusjournal.editorialdoso.com 30 5. Conclusiones Los resultados de este estudio confirman el potencial de Trichoderma harzianum como un a gente biocontrolador eficaz contra Phytophthora palmivora en plántulas de cacao. Estos hallazgos resaltan el alto potencial biocontrolador de TCH - 01, sugiriendo su prometedora aplicación para reducir la incidencia y severidad de P. palmivora en el cultivo de cacao Las diferencias observadas en la capacidad inhibidora de las cepas sobre el crecimiento y la esporulación de Phytophthora palmivora sugieren que los factores genéticos y los perfiles metabólicos juegan un papel clave en su eficacia. TCH - 01 present ó un rendimiento superior, reduciendo significativamente la incidencia y severidad de la enfermedad en las plántulas de cacao. Contribución de los autores: Conceptualización, AV - CM. y KV - AI.; metodología, CF - VB.; software, IF - EG.; validación, AV - CM.; anál isis formal, CF - VB.; investigación, KV - AI.; recursos, IF - EG. y CA - MU.; redacción del borrador original, CA - MU.; redacción, revisión y edición, AV - CM.; visualización, OC - VS.; supervisión, AV - CM. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito. Financiamiento: Esta investigación no ha recibido financiación externa Agradecimientos: Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a la Universidad Técnica Estatal de Quevedo (UTEQ) por su apoyo invaluable durante el desarrollo de este estudio. Agradezco a los docentes, investigadores y al personal administrativo por brindar los recursos necesarios, el acompañamiento y la infraestructura adecuada para llevar a cabo este trabajo . Su compromiso con la formación académica y la investigación ha sido fundamental para el éxito de este proyecto. Declaración de disponibilidad de datos: Los datos están disponibles previa solicitud a los autores de correspondencia: acedenom@uteq.edu.ec Conflicto de interés: Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses Referencias bibliográficas Alfaro - Vargas, P., Bastos - Salas, A., Muñoz - Arrieta, R., Pereira - Reyes, R., Redondo - Solano, M., Fernández, J., Mora - Villalobos, A., & López - Gómez, J. P. (2022). Peptaibol production and characterization from Trichoderma asperellum and their action as biofun gicide. Journal of Fungi (Basel, Switzerland) , 8 (10), 1037. https://doi.org/10.3390/jof8101037 Alfiky, A., & Weisskopf, L. (2021). Deciphering Trichoderma - plant - pathogen interactions for better development of biocontrol applications. Journal of Fungi (Basel, Switzerland) , 7 (1), 61. https://doi.org/10.3390/jof7010061 Amores, F. (2024). History, origin, cultivars, and cacao research in Ecuador. En Sustainable Cacao Cultivation in Latin America (pp. 16 32). Routledge. Asad, S. A. (2022). Mechanisms of action and biocontrol potential of Trichoderma against fungal plant diseases - A review. Ecological Complexity , 49 (100978), 100978. https://doi.org/10.1016/j.ecocom.2021.100978
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